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液相色譜儀分析寡糖鏈結(jié)構(gòu)成分
2014-08-15 [2223]
 1 試劑與儀器
Agilent 1100液相色譜儀;DMX 500核磁共振儀;正相 柱:Nucleosil 100 Silica 5  ,250 lnln×4.6 mm;氨基柱:Hypersil APS-1 250 mill× 4.6 mill,5 m;反相柱:Zorbax ODS 150 lnln×4.6 lnln,5, Sephadex LH-20葡聚糖凝膠;硅膠薄層板、薄層層析顯色劑、DMF、甲基甘露糖、甲基葡 萄糖、甲基半乳糖、Sepharose;(+)-MNB甲酸及(4-)-MNB甲酸由本實(shí)驗(yàn)室方法合成;HPLC所用試劑為國(guó)產(chǎn) HPLC級(jí),其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。葡聚三糖、葡聚六糖由。
 
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 寡糖的熒光衍生化反應(yīng) 取寡糖0.1 mg,按文獻(xiàn)[8]報(bào)道方法將其還原末端還原成糖醇,減壓濃縮至干。生成物溶于0.5 mL干燥的DMSO,加入0.1 mL新配制飽和NaOH水溶液,攪拌20 rain后加入0.2 mL CH I[9】反應(yīng)2 h,常溫減壓蒸餾除去 CH3I,LH-20柱分離純化(柱高 15 cm,內(nèi)徑0.8 cm,移動(dòng)相為,甲醇,流速為0.5 mL/min)。產(chǎn)物濃縮至干,加甲苯共沸除去水分,加入AcC1 5O0  和12 moVL的HC1 50密閉試管中50~C反應(yīng) 1 h。反應(yīng)結(jié)束后 ,反應(yīng)液經(jīng) N:吹干后,用 100  乙酸乙脂溶解,平均分成兩,管,再次用N:吹干,分別加人含有2 mg(+)及(±)-MNB甲酸的DMF溶液5o  ,60~C反應(yīng)0.5 h。
2.2 I-IPLC分析 將2.2.I得到的寡糖熒光衍生物用HPLC移動(dòng)相稀釋后,用于 HPLC分析。
2.3 寡糖 ItPLC分析標(biāo)準(zhǔn)單糖(+)-MNB甲酸衍生物的合成
 
3 結(jié)果與討論
色譜條件的選擇 為有效分離各種單糖衍生物,本研究比較了硅膠柱、氨基柱和 ODS 3種層析柱的分離效果。在 ODS柱上,各樣品保留時(shí)間極為接近,分離效果不好。硅膠柱及氨基柱基本能達(dá)到分離目的,實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在氨基柱上5種單糖的D一,£一手性對(duì)映體能有效分離,保留時(shí)間也相對(duì)較短;而在硅膠柱上,雖 然部分單糖樣品的分離因子及分離度優(yōu)于氨基柱,但是4-0.乙?;?,3,6.三.0.甲基葡萄糖 D.手性 異構(gòu)體的甲酸衍生物不能分開(kāi),改變移動(dòng)相配比,溫度條件等方法也未能達(dá)到分離目的。因此,zui終選擇氨基柱。
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